賽默飛（Thermo Fisher）7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（7500 Real-Time PCR System）的基本操作使用方法，供參考：

一、開機(jī)準(zhǔn)備

1、儀器檢查

確認(rèn)電腦與7500主機(jī)連接正常，電源線、數(shù)據(jù)線無誤。

檢查散熱模塊（如風(fēng)扇）無遮擋。

2、開機(jī)順序

先打開電腦，待系統(tǒng)啟動(dòng)后，再開啟7500主機(jī)電源（主機(jī)開關(guān)位于背面或側(cè)面）。

3、啟動(dòng)軟件

雙擊桌面上的 "7500 Software v2.x"（版本號(hào)可能不同）進(jìn)入操作界面。

二、7500pcr實(shí)驗(yàn)設(shè)置

1、創(chuàng)建新實(shí)驗(yàn)

點(diǎn)擊 "New Experiment"，選擇實(shí)驗(yàn)類型（如Standard Curve、Comparative Ct等）。

設(shè)置反應(yīng)體積（通常為20-50 μL）和檢測通道（FAM/SYBR Green, VIC/HEX等）。

2、設(shè)置反應(yīng)板布局

在軟件界面中點(diǎn)擊板圖（Plate Layout），右鍵選擇樣品類型（標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣品、陰性對(duì)照等）。

輸入樣品名稱、濃度（標(biāo)準(zhǔn)品需設(shè)置梯度）和重復(fù)數(shù)。

3、設(shè)置PCR程序

預(yù)變性階段：95℃, 10分鐘（激活熱啟動(dòng)酶）。

擴(kuò)增循環(huán)（40-45個(gè)循環(huán)）：

變性：95℃, 15秒

退火/延伸：60℃, 1分鐘（溫度根據(jù)引物TM值調(diào)整）。

熔解曲線階段（SYBR Green實(shí)驗(yàn)需添加）：

95℃→60℃→95℃，緩慢升溫（如0.3℃/秒）。

三、加樣與上機(jī)

1、準(zhǔn)備反應(yīng)體系

按試劑盒說明書配制Master Mix（含酶、dNTPs、緩沖液等），加入模板DNA和引物/探針。

混勻后分裝至96孔或384孔反應(yīng)板，避免氣泡。

2、放置反應(yīng)板

將反應(yīng)板放入儀器樣品槽，確保孔位方向與軟件板圖一致。

關(guān)閉儀器蓋，確保密封。

四、運(yùn)行程序

1、啟動(dòng)運(yùn)行

在軟件中點(diǎn)擊 "Start Run"，確認(rèn)反應(yīng)板信息和程序無誤后提交。

儀器將自動(dòng)運(yùn)行溫控和熒光信號(hào)采集。

2、實(shí)時(shí)監(jiān)控

在運(yùn)行過程中可查看擴(kuò)增曲線、熒光閾值（Threshold）和基線（Baseline）設(shè)置。

五、數(shù)據(jù)分析

1、查看結(jié)果

運(yùn)行結(jié)束后，軟件自動(dòng)生成擴(kuò)增曲線、熔解曲線（如設(shè)置）和Ct值。

調(diào)整基線范圍（通常為3-15個(gè)循環(huán)）和閾值線至指數(shù)擴(kuò)增期。

2、導(dǎo)出數(shù)據(jù)

點(diǎn)擊 "Export" 導(dǎo)出Ct值、熒光數(shù)據(jù)為Excel或文本格式。

使用軟件內(nèi)置工具或第三方軟件（如GraphPad）進(jìn)行相對(duì)定量（ΔΔCt法）或絕對(duì)定量（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）。

六、關(guān)機(jī)與維護(hù)

1、關(guān)機(jī)順序

先關(guān)閉軟件，再關(guān)閉7500主機(jī)電源，最后關(guān)閉電腦。

2、清潔維護(hù)

定期用70%乙醇擦拭樣品槽表面，避免污染。

每月運(yùn)行一次儀器自檢程序（可在軟件中找到）。

如需更詳細(xì)的操作步驟，建議參考 《Thermo Fisher 7500 User Manual》 或參加培訓(xùn)。不同實(shí)驗(yàn)（如基因表達(dá)分析、SNP檢測）可能需要調(diào)整具體參數(shù)。